DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE BOTANICHE

 

DOTTORANDI XXIV ciclo

1) Dott.ssa Noemi Tocci

Titolo del progetto:

Hypericum perforatum subsp. angustifolium: Studio della biosintesi di xantoni in planta e in sistemi in vitro

Obiettivi del progetto di ricerca

Il progetto si propone di elucidare alcuni aspetti della via biosintetica degli xantoni nella specie Hypericum perforatum subsp. angustifolium, rivolgendo particolare attenzione all´individuazione dei siti di sintesi (localizzando l´espressione di geni ed enzimi coinvolti nella sintesi) e di accumulo (attraverso analisi HPLC di estratti derivanti dai diversi organi della pianta) dei metaboliti di interesse. Gli xantoni sono dei metaboliti secondari appartenenti alla classe dei composti fenolici e comprendono molte molecole con interessante e documentata attività biologica. Nella maggior parte dei casi la loro complessa struttura molecolare li rende di difficile ottenimento per sintesi chimica e le biotecnologie vegetali potrebbero rappresentare una importante via di produzione alternativa. Il presente studio intende avvalersi delle tecniche di coltura in vitro per sviluppare un sistema di produzione su larga scala di estratti vegetali ricchi in xantoni con interessanti attività biologiche. Durante lo svolgimento del dottorato saranno allestite colture cellulari e di organi e saranno valutati gli effetti di differenti trattamenti colturali e l´azione di stimoli esterni, al fine di ottimizzare la produzione di xantoni. Infine lo studio si propone di testare alcune possibili applicazioni farmacologiche degli estratti.

I anno:

Durante il primo anno di dottorato sono stati completati gli studi, già avviati durante il lavoro di tesi specialistica, di localizzazione dell´organo di accumulo degli xantoni nella pianta. Grazie alle analisi HPLC degli estratti ricavati dai diversi organi, è stato possibile evincere che nella specie H.perforatum subsp. angustifolium, gli xantoni sono principalmente accumulati nelle radici, ma in quantità soggette a variabilità in relazione alla stagionalità e allo stadio di sviluppo della pianta  e molto basse per possibili fini applicativi. Parallelamente sono state allestite colture cellulari e di radici rigenerate in vitro e per entrambi i sistemi sono state ottimizzate le condizioni colturali e testati alcuni elicitori del metabolismo secondario. In particolar modo le colture di radici si sono rivelate in grado di sostenere una produzione di xantoni stabile e molto superiore alle quantità riscontrate nelle piante coltivate in campo. Inoltre la sintesi di xantoni nelle colture di radici si è dimostrata sensibile al trattamento con chitosano, caratteristica che permette a tali colture di essere utilizzate anche come sistema modello per studi molecolari sui geni e gli enzimi coinvolti nella biosintesi dei metaboliti di interesse.

II anno:

Durante il secondo anno di dottorato le colture di radici sono state utilizzate come sistema modello per gli studi di biologia molecolare volti al clonaggio della benzofenone sintasi, enzima chiave coinvolto nel metabolismo degli xantoni, per i successi studi di espressione genica e proteica in pianta. Il cDNA della benzofenone sintasi è stato clonato da radici sottoposte a trattamento con chitosano e, successivamente, l´enzima è stato espresso in E.coli e caratterizzato dal punto di vista funzionale.

 

PERIODI DI RICERCA ALL´ESTERO

Soggiorno di 15 mesi presso il Laboratorio di Biologia Farmaceutica dell´Università Carolo Whilelmina di Braunschweig (Germania), responsabile Prof. Beerhues, con il quale si è attivata una cotutela di tesi di dottorato

LAVORI IN EXTENSO

Tocci N., Ferrari F., Santamaria A.R., Valletta A., Rovardi I., Pasqua G., 2010 "Chitosan enhances xanthone production in Hypericum perforatum subsp. angustifolium cell cultures". Natural Product Research 24(3) 286 — 293

PROCEEDINGS

Valletta A., Tocci N., Ferrari F., Miccheli A., Miccheli AT., Pasqua G. Effetto del chitosano sulla biosintesi di xantoni e flavonoidi in colture cellulari di Hypericum perforatum subs. angustifolium . Convegno dei gruppi di lavoro "Biotecnologie e Differenziamento" e "Biologia Cellulare e Molecolare" della Società Botanica  Italiana, (2008, Parma).

Tocci N., Simonetti G., D´Auria F.D., Panella S., Valletta A., Pasqua G. Produzione di xantoni da radici avventizie di Hypericum perforatum subsp. angustifolium ed attività antifungina. Convegno dei gruppi di lavoro "Biotecnologie e Differenziamento" e "Biologia Cellulare e Molecolare" della Società Botanica  Italiana, (2010, Lecce)

POSTER

Tocci N., Valletta A., Zodi R., Liu B., Beerhues L., Pasqua G. Radici in vitro di Hypericum perforatum subsp. angustifolium come modello per lo studio della via biosintetica degli xantoni. 105° Congresso S.B.I., Milano, 25/28 agosto 2010.

 

 

2) Dott.ssa Alessandra Ricelli

Titolo tesi:

Prevenzione della contaminazione da ocratossina A in uve da tavola mediante lotta biologica

Introduzione

La coltivazione della vite (Vitis vinifera) rappresenta una importante realtà nel panorama agricolo europeo e in particolare in quello italiano. Questa pianta presenta diversi problemi fitosanitari. essendoattaccata da diversi tipi di patogeni, sia insetti che microorganismi fungini i quali hanno un effetto negativo sia sulla quantità che sulla qualità delle produzioni. In particolare l´attacco da parte di funghi patogeni rappresenta un rischio considerevole non solo per la perdita di prodotto, ma anche per la possibilità di contaminazione da parte dei metaboliti fungini. Tra questi l´ocratssina A (OTA) riveste una particolare importanza sia per la sua frequenza di rilevamento che per la sua pericolosità essendo immunotossica, nefrotossica e cancerogena per l´uomo e per gli animali. La contaminazione da OTA nelle uve è legata alla presenza e allo sviluppo di funghi appartenenti al raggruppamento degli “Aspergilli neri” in particolare Aspergillus carbonarius e Aspergillus niger. Il biocontrollo sta acquisendo un rilievo e un interesse crescenti come strategia di prevenzione delle infezioni fungine. Tra le proposte emerse, ancora soltanto a livello sperimentale, c´è quella del possibile utilizzo di antiossidanti “food grade” come composti capaci non solo di prevenire la produzione di questa micotossina ma di migliorare nello stesso tempo la qualità degli alimenti trattati. In questo senso diversi studi sono stati fatti circa la presenza di resveratrolo nelle uve e nei vini prodotti. Il resveratrolo è una fitoalessina prodotta da diverse specie di piante tra cui la vite, esso è noto per i suoi effetti antiossidanti e benefici sulla salute. Recenti studi effettuati su bacche di alcuni cultivar di uva da vino hanno evidenziato una possibile correlazione tra l´aumento della biosintesi di resveratrolo in seguito all´attacco fungino e controllo della produzione di OTA da parte del fungo tossigeno. Inoltre è stato riscontrato che la presenza di lieviti appartenenti al genere Saccharomyces durante i processi di vinificazione possa ridurre la concentrazione di OTA grazie soprattutto all´effetto adsorbente delle pareti di questi microrganismi sulla tossina. Questi osservazioni sono state effettuate su uve da vino o sui loro prodotti (mosto, vino), mentre è scarso il numero degli studi fatti in maniera specifica sulle uve da tavola, d´altra parte è noto che l´OTA rappresenta un problema anche per questo tipo di prodotto, in quanto sono stati isolati ceppi di A. carbonarius e A. niger anche da questa coltura e i pur scarsi studi effettuati su questa derrata hanno evidenziato la presenza di ocratossina A.

Scopo del lavoro

Lo scopo di questa ricerca è quello di individuare alcuni cultivar di uva da tavola relativamente resistenti all´attacco da parte dei principali funghi produttori di ocratossina A su questa derrata alimentare: Aspergillus carbonarius e a A niger e di studiare gli effetti delle modalità di conservazione sulla suscettibilità delle bacche di uva sia all´attacco dei funghi tossigeni considerati che alla produzione di ocratossina. Sarà verificata anche l´eventuale correlazione tra minore suscettibilità all´attacco e migliore risposta in termini di sintesi di resveratrolo.  Inoltre verrà  studiata la risposta delle bacche di uva contaminate da Aspergillus carbonariusA niger al trattamento con alcuni ceppi di lievito appartenenti ai generi Rhodotorula e Saccharomyces già identificati come GRAS.. Lo scopo finale di questo studio sarà quello di aumentare le conoscenze sulle correlazioni tra l´attacco di A. carbonarius e A. niger  e sintesi di resveratrolo e sulla capacità di alcuni ceppi di lievito di adsorbire o degradare l´OTA prodotta. Questo consentirà di  proporre alcuni cultivar di uva da tavola come più adatti per la conservazione e l´esportazione e di proporre una strategia alternativa per il controllo della presenza di questo contaminante sull´uva da tavola.

Pubblicazioni

Ayoub F., Reverberi M, Ricelli A, Donghia A., Yaseen T. 2010, Early detection of Aspergillus niger and A. carbonarius on table grapes: a tool for quality improvement. Food Add. And Contam. 27 (9) 1285-1293

De Rossi P., Ricelli A., Fabbri A.A., Fanelli C., Caputo D., de Cesare G., Scipinotti R., Reverberi M. 2010, Early detection of ochratoxigenic fungi in wine grapes and of ochratoxin A in wine. Annals of Microbiology DOI: 10.1007/s13213-010-0107-3.

Ricelli A., Reverberi M., Punelli F., Fabbri A.A., Fanelli C. Correlation between cell lipoperoxidation and ochratoxin A production in some toxigenic fungi. 5th Indo-Italian workshop on Chemistry and Biology of Antioxidants 05-09/07/2009, Rome, Italy

Attività didattica

Correlatore di due tesi specialistiche presso la facoltà di Scienze MM. FF. NN. "Sapienza" polo di Latina, Biotecnologie Agro-Industriali. Tutor di due tesi "Master of Science Integrated Pest Management of Mediterranean fruit Tree Crops" presso l´Istituto Agronomico Mediterraneo di Bari.



3) DOTT.SSA MARTA PUNELLI

Titolo tesi:

Studio dell´interazione Aspergillus flavus - Zea mays: un approccio genomico, fenomico e lipidomico

Durante il mio Dottorato sono stati studiati, mediante un approccio trascrittomico, tutti i geni di A. flavus che vengono differenzialmente regolati durante l´interazione con l´ospite (mais), individuando in questa almeno 3 ipotetiche fasi:

-     una fase saprofitica: crescita del micelio in assenza dell´ospite o su ospite morto

-     una fase chemiotrofica: crescita direzionale del micelio verso dei chemio-attrattanti prodotti da semi vivi feriti

-     una fase patogenica: crescita in pianta (cariosside).

Per studiare l´interazione A. flavus-mais, è stato messo a punto un biosaggio il cui scopo era quello di riprodurre ciò che avviene durante il ciclo di infezione di A. flavus. La fase saprofitica (SAPR) è stata ricreata inoculando dei conidi di A. flavus su semi di mais non vitali (autoclavati); nella fase chemiotrofica (CHEM) il fungo è stato fatto crescere in una beuta di terreno minimo con un basso contenuto di saccarosio, all´interno del quale è stato immerso un tubo da dialisi (cut-off 7000Da) contenente dei semi vitali precedentemente feriti con ago sterile (i composti diffusibili emessi dall´ospite sono così in grado di uscire dal tubo da dialisi per elicitare delle risposte da parte del fungo); è stata ricreata, come controllo negativo, una fase (FLASK) in cui il fungo cresce utilizzando soltanto i componenti presenti sul terreno di crescita (semplice crescita in vitro su terreno minimo con un basso contenuto di saccarosio); infine la fase patogenica (IN VIVO) è stata ottenuta direttamente in campo, ferendo le pannocchie di mais ed inoculandole con i conidi di A. flavus. I miceli di queste quattro fasi sono stati recuperati ai fini di estrarre l´RNA per studiarne il trascrittoma ed estrarre i lipidi e le ossilipine per ottenere un profilico lipidico ed ossilipinico del fungo durante tutte le fasi di interazione col mais.

Il ciclo di infezione dell´A. flavus in mais consiste di una iniziale fase di crescita saprofitica in cui il patogeno si sviluppa sui residui vegetali del mais che si trovano nel terreno. Da qui si formano conidi che, trasportati dal vento o da insetti vettori, si posano sulle cariossidi. In generale, quando i tessuti vegetali vengono feriti, o comunque danneggiati da eventi esterni (wounding, masticamento di insetti), emettono delle sostanze volatili, dette BVOCs (Biogenic Volatile Organic Compounds). Queste BVOCs rilasciate dalle cariossidi possono stimolare la germinazione delle conidiospore di A. flavus. A questo punto il micelio del patogeno si sviluppa soprattutto nell´embrione ricco in lipidi dove successivamente differenzia una notevole quantità di conidi per i cicli di infezione secondaria e sintetizza le aflatossine, molto probabilmente per impedire ad altri competitors di nicchia, quali insetti, di crescere.

Nel primo anno di Dottorato, dall'approccio trascrittomico sono state ottenute numerose informazioni, molte ancora in via di sviluppo, che hanno fornito nuovi spunti di studio sull'interazione tra mais e A. flavus.

Un altro approccio per comprendere meglio come uno stimolo venga "percepito" e "trasformato" nell´attivazione del metabolismo secondario è quello di considerare come l´energia sia distribuita all´interno della cellula. Studi recenti hanno indicato che i perossisomi giocano un ruolo nella distribuzione dell´energia e delle fonti di carbonio necessarie per la biosintesi di aflatossina/sterigmatocistina. Per esempio, in condizioni di stress ambientale, come durante l´interazione con l´ospite o l´esaurimento dei nutrienti, i perossisomi proliferano e determinano un aumento della ossidazione degli acidi grassi.
La degradazione completa degli acidi grassi fornisce l´unità acetato necessaria per la sintesi di AF/ST ed il maggior numero di perossisomi fornisce, inoltre, un sito per l´accumulo di acido norsolorinico, il primo intermedio stabile che si forma nella via biosintetica delle aflatossine.

Dai risultati ottenuti durante il primo anno di Dottorato si era visto, infatti, come un mutante con una forte iperproliferazione numerica dei perossisomi (indotta dalla mutazione) presentava, durante l´interazione con il mais, una forte attivazione del metabolismo secondario, arrivando a produrre una quantità di aflatossine fino a 7 volte maggiore rispetto a quella prodotta dal ceppo WT.

Durante il secondo anno gli obiettivi principali sono stati l´individuazione, mediante utilizzo dei software SMURF e Finite State Machine, delle vie biosintetiche sia del metabolismo primario che secondario differenzialmente espresse durante la fase patogenica e  durante la fase di “avvicinamento” chemiotrofico; focalizzando l´attenzione su questi aspetti, si è iniziato a chiarire il coinvolgimento di determinati geni durante la patogenesi del fungo.

Il lavoro è stato suddiviso nei seguenti punti:

1) Studio del ruolo di geni  differenzialmente espressi nelle diverse fasi dell'interazione attraverso genetica inversa. In particolare, sono stati generati:

- un mutante di A. flavus che presenta l´interruzione genica del gene lox1, codificante per una 15-arachidonato lipossigenasi, per studiare la capacità delle ossilipine prodotte da questa LOX di elicitare eventuali risposte difensive in mais;

- un mutante di A. flavus che presenta l´interruzione genica del gene Mnsod, codificante per una Mn-SOD mitocondriale;

- un mutante di A. flavus che presenta l´interruzione genica del gene Ahr, codificante per una alkyl-idroperossido reduttasi.

2) Analisi delle emissioni di BVOCs da parte dei semi di mais feriti e durante le diverse fasi di contatto con il patogeno.

3) Caratterizzazione fenomica del ceppo WT mediante il Phenotypic MicroArray (Biolog) ed il confronto dei fenomi ottenuti durante le diverse fasi di interazione del fungo con i semi di mais, con il fine di produrre la mappa metabolica di questa specie e definire un primo quadro della variabilità metabolica del ceppo durante le diverse fasi di interazione. I dati genomici e fenomici saranno poi combinati, con l'ausilio di strumenti di bioinformatica, per produrre una prima mappa di connessioni putative tra geni ed attività metaboliche.

ELENCO ATTIVITA´ DIDATTICHE:

Assistenza a studenti durante il loro lavoro di Tesi Sperimentale.

In particolare, ho seguito le studentesse Tatiana Belleudi e Claudia Bucchi, facenti parte entrambe del corso di studi in Biotecnologie Agro-Industriali (laurea triennale); sto tuttora seguendo la studentessa Eleonora Di Fabio, iscritta a Biotecnologie Industriali e Ambientali (laurea specialistica).

 

Elenco Pubblicazioni:

Reverberi M., Punelli M., Smith C.A., Punelli F., Zjalic S., Ricelli A., Payne G.A., Fabbri A.A. and Fanelli C. "Cell redox balance, lipid metabolism and aflatoxin biosynthesis in Aspergillus Sect. Flavi". Journal of Plant Parhology (2007), vol 89 (3, Supplement), S21. XIV Congresso S.I.Pa.V., Perugia 18-21 settembre 2007.

Smith CA, Punelli M, Reverberi M and Payne GA. "NADH oxidase nadA, a link between aflatoxin and oxidative stress in Aspergillus flavus". (2007). Source: PHYTOPATHOLOGY   Volume: 97  Issue: 7  Pages: S109-S109   Supplement: Suppl. S Published: JUL 2007

Reverberi M., Punelli M., Smith C.A., Punelli F., Zjalic S., Ricelli A., Payne G.A., Fabbri A.A. and Fanelli C. "Cell redox balance, lipid metabolism and aflatoxin biosynthesis in Aspergillus Sect. Flavi" (2008). European Conference on Fungal Genetics (ECGF9), Edimburgo (Scozia) 5-8 aprile 2008.

Punelli M., Smith C.A., Pinzari F., Cardinali G., Aspite N., Rubino L., Russo S., Payne G., Fabbri A.A., Fanelli C. and Reverberi M. “Aflatoxin biosynthesis is correlated to peroxisome functionality, lipid metabolism and oxidative stress in Aspergillus flavus” (2009). The 25th Fungal Genetics Conference, Asilomar, Marzo 17-22, 2009.

M. Punelli, C.A. Smith, A. Ricelli, F. Pinzari, G. Cardinali, N. Aspite, S. Russo, G.A. Payne, A.A. Fabbri, C. Fanelli and M. Reverberi "Peroxisome functionality, lipid metabolism and oxidative stress affect aflatoxin biosynthesis and development in Aspergillus flavus". Journal of Plant Parhology (2009), vol 91 (4, Supplement), S4.38. XV Congresso S.I.Pa.V., Locorotondo (Bari), 28 settembre – 1 ottobre 2009. (speaker).

Punelli M., Reverberi M., Uva P., Mentzen W., Dolezal A.L., Woloshuk C., Fabbri A.A., Fanelli C. and Payne G.A. Genes differentially expressed by Aspergillus flavus in the interaction with Zea mays”. Petria (2010), vol 20 (2), 389-390. 13t Congress oh the Mediterranean Phytopathological Union (MPU), Roma, 13-18 giugno 2010. (speaker).

Punelli M., Smith C.A., Ricelli A., Pinzari F., Cardinali G., Aspite N., Russo S., Payne G.A., Fabbri A.A., Fanelli C. and Reverberi M. (2010) "Wild type and mutant strain of Aspergillus flavus compared by means of phenotype microarray technique: metabolic effect of induced peroxisome hyperproliferation". Florence Conference on Phenotype MicroArray Analysis oh Microorganisms, 2nd Edition, Firenze, 13-15 settembre 2010.

Punelli M., Reverberi M., Uva P., Mentzen W.I., Dolezal A.L., Woloshuk C., Scarpari M.,  Fabbri A.A., Fanelli C. and Payne G.A. (2010). “Study of the genes differentially expressed during the interaction between Aspergillus flavus and Zea mays”. XVI Congresso S.I.Pa.V., Firenze, 14-17 settembre 2010. (on press)

Scarpari M., Fabbri A.A., Fanelli C., Cescutti P., Rizzo R., Herasimenka Y., Punelli M., Zjalic S., Ricelli A., Reverberi M. (2010) “Natural compounds from Trametes versicolor inhibit growth and mycotoxins biosintesis of different fungi”. XVI Convegno Nazionale S.I.Pa.V. Firenze, 14-17 settembre 2010. (on press)

Reverberi M., Punelli M., Scarpari M., Ricelli A., Fabbri A.A. and Fanelli C. (2010) “The lipid language of plant fungal interactions”. XX Congresso SITE, Roma, 27-30 settembre 2010

Punelli M., Reverberi, M., Uva, P., Mentzen, W., Dolezal, A.L., Woloshuk, C., Fabbri, A.A., Fanelli, C. and Payne, G.A. (2010). “Genes differentially expressed by Aspergillus flavus in the interaction with Zea mays”. The World Mycotoxin Forum, 6th Conference, Amsterdam, 8-10 novembre 2010.