DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE BOTANICHE

 

DOTTORANDI XXV ciclo

1) Dott.ssa Elisa Bastianelli

Titolo tesi:

STUDIO DELLE BASI MOLECOLARI DELLA DIGERIBILITA´ DELLA PARETE CELLULARE: RUOLO DELLA STRUTTURA PECTICA NELLA SACCARIFICAZIONE DI ARABIDOPSIS

Le pareti cellulari vegetali rappresentano una risorsa rinnovabile di biomassa che può essere utilizzata come fonte energetica alternativa volta alla produzione di etanolo. Il principale vantaggio dell´utilizzo di materiale lignocellulosico è rappresentato dalla sua abbondanza.

Uno dei processi chiave nella produzione di etanolo dalla biomassa lignocellulosica è la saccarificazione. La saccarificazione consiste nella degradazione dei polisaccaridi in zuccheri fermentabili. Questa degradazione può essere effettuata mediante idrolisi acida, ma questa strategia comporta costi elevati e non è competitiva in termini industriali. In alternativa si ricorre ad idrolisi enzimatica. La biomassa vegetale lignocellulosica risulta però recalcitrante all´azione idrolitica enzimatica. Per ridurre la recalcitranza delle pareti cellulari all´idrolisi enzimatica sono necessari processi di pretrattamento che comportano la separazione fisica della cellulosa e dell´emicellulosa dalla lignina. Modificazioni strutturali della parete cellulare possono essere utili per ridurre i costi di pretrattamento.

Una componente di parete particolarmente critica nelle dicotiledoni per l´integrità dei tessuti e l´accessibilità degli enzimi degradativi è la matrice pectica che avvolge la rete di cellulose ed emicellulose. È noto che le pectine, ed in particolare l´acido poligalatturonico (HGA), che ne rappresenta una componente maggioritaria, influenzano la plasticità e l´adesione cellulare.

Il mio progetto di dottorato si propone di verificare la correlazione tra l´efficienza di saccarificazione e la presenza di specifici domini strutturali nella componente pectica, esplorando le diversità strutturali delle pareti cellulari in ecotipi presenti in natura. Questo studio cerca di proporre una alternativa ad un approccio di ingegneria genetica finalizzato alla produzione di piante trasformanti modificate nelle componenti parietali.

Nell´ambito di questa ricerca ho iniziato la caratterizzazione di una collezione di 25 accessioni di Arabidopsis thaliana, scelte tra 265 per garantire il massimo grado di variabilità genetica.

Le analisi che ho condotto sugli ecotipi naturali prevedono l´esecuzione di saggi enzimatici, biochimici ed immunochimici applicati nelle seguenti analisi:

-         misurazione della efficienza di saccarificazione enzimatica di tessuti vegetali;

-         quantificazione immunochimica di particolari epitopi pectici mediante l´utilizzo di anticorpi specifici per differenti pattern di metilazione;

-         quantificazione del grado di metilazione della pectina.

 

PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI

Poster- V. Lionetti; F. Francocci; S. Ferrari; D. Bellincampi; D. Pontiggia; L. Mariotti; E. Bastianelli; M. Benedetti; G. De Lorenzo; F. Cervone, The structure of homogalacturonan is critical for plant biomass processing.  II° Congresso della Società Italiana di Biologia Vegetale. Roma 12-14 luglio 2010, PVI08.

Poster- M. Benedetti; E. Bastianelli; G. De Lorenzo;  G. Salvi; C. Caprari; F. Cervone, In vitro evolution highlights the residue 224 paper of pgips (polygalacturonase-inhibiting proteins) as a primary spot of variability for improvement of inhibition capability. II° Congresso della Società Italiana di Biologia Vegetale. Roma 12-14 luglio 2010, PV24.

Proceeding- F. Cervone; V. Lionetti; F. Francocci; S. Ferrari; D. Bellincampi; D. Pontiggia; L. Mariotti; E. Bastianelli; G. De Lorenzo, The esterification status and the lenght of acidic stretches of homogalacturonan is critical for plant biomass processing. XII Cell Wall Meeting, Porto (Portogallo) 25-30 luglio 2010, T43.

Manoscritto sottomesso a Journal of Plant Pathology - M. Benedetti; E. Bastianelli; G. De Lorenzo;  G. Salvi; C. Caprari, In vitro evolution highlights the residue 224 paper of pgips (polygalacturonase-inhibiting proteins) as a primary spot of variability for improvement of inhibition capability.

 

PARTECIPAZIONE A CONGRESSI

II° Congresso della Società Italiana di Biologia Vegetale. Roma 12-14 luglio 2010.

 

2) Dr. Manuel Benedetti

 

I temi affrontati nel mio dottorato di ricerca sono stati i seguenti:

1) Evoluzione in vitro: analisi di varianti di PvPGIP2 mutate casualmente allo scopo di ottenere inibitori con nuove specificità di riconoscimento. Su tale progetto è stato scritto un lavoro che è stato sottomesso alla rivista "Journal of Plant Pathology": "ARTIFICIAL EVOLUTION CORRECTS A REPULSIVE AMINO ACID IN POLYGALACTURONASE INHIBITING PROTEINS (PGIPs)."(autori: Manuel Benedetti, Elisa Bastianelli, Giulia De Lorenzo, Gianni Salvi e Claudio Caprari). Il lavoro è stato accettato ed è in fase di stampa.

2) Studio del complesso tra la PGIP isoforma 2 di Phaseolus vulgaris (PvPGIP2) e la PG di Fusarium phyllophilum (FpPG): studio del complesso tramite SAXS (Small Angular Xray Scattering). Su tale progetto è stato presentato un poster al XII Cell Wall Meeting (Oporto dal 25 al 30 luglio 2010)  dal titolo "STUDY OF THE COMPLEX BETWEEN PG OF  Fusarium phyllophilum AND PGIP2 OF Phaseolus vulgaris BY SMALL ANGULAR X-RAY SCATTERING" (autori: Benedetti M. e Leggio C., De Lorenzo G., Pavel NV e Cervone F). Su tale progetto sarà scritto un lavoro dal titolo "THE STRUCTURE IN SOLUTION OF THE COMPLEX BETWEEN A FUNGAL POLYGALACTURONASE AND  A PLANT POLYGALACTURONASE INHIBITING PROTEIN (PGIP) REVEALED BY SMALL ANGLE X-RAY SCATTERING". (autori: Manuel Benedetti, Claudia Leggio, Luca Federici, Giulia De Lorenzo, Nicolae Viorel Pavel e Felice Cervone)

3) Utilizzazione di un costrutto codificante una proteina di fusione tra PG e PGIP per ottenere piante transgeniche: caratterizzazione delle piante transgeniche in termini di resistenza ai patogeni e saccarificazione. In questo ultimo anno di dottorato sto cercando di ottenere la pianta transgenica da poter sottoporre ad analisi e caratterizzazione.

 

 

3) Dott.ssa Federica Della Rovere

Titolo tesi:

Studio dell´organizzazione del centro quiescente e dell´attività del meristema apicale nelle radici avventizie di Arabidopsis thaliana

Tutor: Prof. M. M. Altamura

Attività di ricerca svolta dalla Dott.ssa Federica Della Rovere

La radicazione avventizia è un processo essenziale per garantire la sopravvivenza di numerose specie vegetali, inoltre, dal punto di vista biotecnologico è da notare che la capacità di formare radici avventizie è una condizione indispensabile nella propagazione clonale di specie erbacee e legnose di interesse commerciale. Arabidopsis thaliana, specie presa in esame nel Progetto di Dottorato di Ricerca, allo stadio di plantula, produce normalmente una o due radici avventizie alla base dell´ipocotile, tuttavia la sua potenzialità rizogenica viene aumentata dall´ auxina esogena, da specifiche concentrazioni di saccarosio, da totale oscurità e dal contatto diretto dell´ipocotile con il mezzo colturale. La crescita indeterminata degli organi vegetali viene mantenuta dall´attività localizzata, nel meristema apicale, della nicchia delle cellule staminali, che comprende sia le cellule iniziali che le cellule del centro quiescente. In molte delle ricerche presenti in letteratura specifici marcatori, chiamati QC25, QC46, QC184 e pAGL42::GFP, sono stati di notevole aiuto per la comprensione della funzionalità del centro quiescente della radice primaria e laterale. Alcuni di questi marcatori sono stati presi in considerazione nella mia ricerca di Dottorato, in quanto, una volta caratterizzato cito-istologicamente il centro quiescente nelle radici avventizie, possono risultare utili per definirne la funzionalità sotto diverse condizioni di crescita e sviluppo. È noto da tempo che l´auxina influenza in Arabidopsis lo sviluppo radicale post-embrionale, ed è stato dimostrato che il “maximum auxinico” influenza la localizzazione della nicchia staminale. Ad oggi non è noto se vi sia un maximum auxinico nell´apice della radice avventizia matura, ed in caso affermativo, come si definisca. La mia ricerca quindi, si propone di indagare l´organizzazione del meristema apicale, in particolare la definizione del centro quiescente, nelle radici avventizie di Arabidopsis sia in planta che nel sistema sperimentale degli strati cellulari sottili. La ricerca ha anche lo scopo di indagare il ruolo di geni coinvolti nella biosintesi dell´auxina e di evidenziare i siti di accumulo dell´ormone nel processo rizogenico e nella protrusione del primordio radicale avventizio.

 

Attività scientifiche svolte all´estero

Partecipazione su invito all´ "European Networking Summer School (ENSS) Plant Epigenetics" presso l´IPK di Gatersleben (Germania), dal 20 al 24 settembre 2010, dove è stato presentato il lavoro dal titolo "The Arabidopsis BET Bromodomain Factor GTE4 is involved in maintenance of the mitotic cell cycle";

Partecipazione al "3rd International PhD School Plant Development" presso Retzbach (Germania), dal 6 all´8 ottobre 2010, dove è stato presentato il poster dal titolo "Development of the quiescent center and definition of the auxin maximum in Arabidopsis adventitious roots in planta".

Pubblicazioni

Della Rovere F., Airoldi C., Falasca G., Ghiani A., Fattorini L., Citterio S., Kater M., Altamura M.M. (2010)- The Arabidopsis BET bromodomain factor GTE4 regulates the mitotic cell cycle. Plant Signalling & Behavior. 5:6; 1-4.

Airoldi C.,* Della Rovere F.,* Falasca G., Marino G., Kooiker M., Altamura M.M., Citterio S., Kater M.M. (2010)- The Arabidopsis BET bromodomain factor GTE4 is involved in maintenance of the mitotic cell cycle during plant development. Plant Physiology. 152: 1320-1334.* Questi autori hanno contribuito parimenti al lavoro.

 

4) Dott.ssa Vanessa Modesti

Titolo tesi:

LA PROTEIN CHINASI ASSOCIATA ALLA PARETE VEGETALE (WAK) NELLA DIFESA CONTRO I PATOGENI E NEI PROCESSI DI SVILUPPO

La parete cellulare è una delle prime linee di difesa contro i microrganismi. Essa è composta da polisaccaridi; tra questi la pectina è la prima componente che viene degradata per azione degli enzimi microbici. In particolare, le poligalatturonasi fungine, ormai considerate dei fattori di virulenza, in concerto con i corrispettivi inibitori proteici presenti a livello ipoplastico, le PGIP (Polygalacturonase Inhibiting Protein), determinano la formazione e l´accumulo degli oligogalacturonidi (OG), frammenti di omogalatturonano (il maggior componente pectico). Gli OG hanno una duplice funzione;  sono implicati nei processi di difesa e quindi sono considerati dei DAMP (profili molecolari associati al danno) e nel regolare la crescita delle piante. E´ noto che alcuni  membri della famiglia WAK (Wall-Associated Kinase) si legano a questi oligosaccaridi in vitro. Le proteine WAK sono coinvolte in importanti processi fisiologici, quali l´espansione cellulare ed i processi di sviluppo, sono degli ottimi candidati per la risposta a molecole segnale, essendo coinvolti nella trasduzione del segnale tra l´ambiente extracellulare e quello intracellulare durante la risposta a vari tipi di stress biotici e abiotici. In Arabidopsis, sono stati trovati 5 diversi geni codificanti proteine WAK. Recentemente è stato identificato in WAK1 il recettore degli OG. È noto da studi in vitro, che il dominio extracellulare di WAK1 interagisce sia con le pectine che con un´altra componente della matrice extracellulare, la proteina ricca in glicina, AtGRP-3. È noto inoltre che il complesso WAK1-AtGRP-3 può interagire a livello citoplasmatico con la fosfatasi KAPP, coinvolta nella regolazione negativa di vie di segnalazione importanti nei processi di sviluppo e durante la patogenesi.

Lo scopo della mia ricerca di dottorato, è quello di comprendere ed approfondire il ruolo dei recettori WAK nei meccanismi di difesa contro i patogeni, nella percezione degli OG e di valutare il coinvolgimento di KAPP e GRP3 nel meccanismo di trasduzione del segnale mediato dal WAK1.

 

COMUNICAZIONI A CONGRESSI:

Poster:F. Sicilia, A. Brutus, V. Modesti, G. Gramegna, F. Andreani, A. Macone, F. Cervone, G. De Lorenzo. "A chimeric receptor approach for the manipulation of danger sensing apparatus of plants". II Congresso della Società Italiana di Biologia Vegetale. Roma  12– 14 luglio, 2010.

 

PARTECIPAZIONE A CONGRESSI:

II Congresso della Società Italiana di Biologia Vegetale. Roma 12-14 luglio, 2010.